-
Конфокальный микроскоп относится к своего рода специальному оптическому микроскопу, который может записывать оптические срезы.
Проявляя и наблюдая за одной предельной точкой дифракции, оптическое нарезка реализуется в лазерной конфокальной системе. Это требует, чтобы два сегмента луча имели одинаковую фокусировку, поэтому они «конфокальные». В отличие от изображений с широким полем, конфокальные изображения не имеют размытого размытия. Это само по себе преимущество, потому что глубокий образ выборки ясен и богат в деталях. Тем не менее, наиболее важным преимуществом является его трехмерная потенциал визуализации с микроскопическими признаками. После того, как последовательность изображения получена вдоль Z-Stack, 3D-объект реконструируется и отображается компьютером.
- Конфокальное освещение
Освещение источника точечного света реализуется путем фокусировки источника света на небольшой апертуре (обшивка), а затем фокусируя его на образце. Когда апертура достаточно мала, точка освещения ограничена только дифракцией, а не геометрическими параметрами источника света и апертуры. Обычный источник света является большим источником поверхностного света, поэтому невозможно сфокусировать его на пределе дифракции. Следовательно, хотя коэффициент пропускания очень низкая, этот вид фокусированного освещения все еще очень необходим (для традиционных источников света).
Рисунок 1: Освещение для конфокальной визуализации. Свет из источника света (LS) сосредоточен на облигации (PI), а затем входит в образец S ..
Лазер как источник света имеет очень высокую коллимацию (свет в хорошем лазере «чрезвычайно параллельна»). Следовательно, лазер может быть сфокусирован на ограниченном дифракционном месте через одну линзу без использования заглушки. Следовательно, большинство конфокальных микроскопов нет. Качество светового пятна зависит от качества луча лазера. Если качество не подходит, вы также можете вставить освещение. Лазер обычно связан с конфокальным микроскопом с помощью оптического волокна. Эти волокна сами также действуют как выходы.
Фокализация и высокая плотность энергии лазера делают его идеальным источником света для конфокального микроскопа. Когерентность лазера не является обязательной особенностью конфокальной производительности. Напротив, это проблема для оптических дизайнеров, потому что это вызовет ложные интерференционные модели, поэтому необходимы тщательные стратегии проектирования.
Кроме того, тот факт, что традиционный лазер издает только один цвет (Laser- "Line"), имеет свои собственные ограничения. При многофлуоресцентной визуализации и измерениях необходимо сложное много лазерное расположение. Белый лазер умело решает проблему многоцветной визуализации.
Рисунок 2: Сравнение конфокальной (правой площади) и неконфокальной визуализации. В окрашенной в Фулген трофобласт мыши. Много информации о неконфокальных изображениях не поступает из фокальной плоскости. Конфокальная оптика устраняет все нечеткие факторы и делает структуру ясной.
Конфокальное обнаружение
Большинство детекторов имеют довольно большую чувствительную область (фотоумножильные трубки обычно представляют собой несколько квадратных сантиметров). Конфокальная оптика нуждается в зондировании точек. Следовательно, необходимо выполнить обнаружение пятен, вставив небольшую апертуру (бунхола) в луче света. Фокусируя свет образца на заглушке, собирая и записывая передаваемый свет.
Поскольку дифракционная картина зависит от численной апертуры и длины волны, необходимо обнаружение оберновой скважины. Следовательно, когда эти параметры изменяются, размер заглушки должен быть отрегулирован.
Когда объективная линза меняется (обычно с изменением численной апертуры), современный конфокальный сканирующий микроскоп автоматически изменяет диаметр точечной отверстия надлежащим образом. Следовательно, выходы обычно разрабатываются как двойные или многослойные апертуры.
Фактически, соответствующий размер заглушки зависит не только от длины волны и численной апертуры, но и от внутреннего увеличения оптических элементов в микроскопе.
Следовательно, это не только нежелательно, но и неправильно, чтобы непосредственно сравнивать диаметры обшивки в микроскопах с различными конструкциями. Если диаметр точечной отверстия не устанавливается оптимальному значению, система не сможет плавно выполнять оптическое нарезку (то есть размытие дефокусировки передачи) или не разрезать интенсивность без необходимости без получения дополнительного качества оптического нарезки (что приводит к ненужным изображениям шума).
Рисунок 3: Обнаружение в конфокальной визуализации. Свет из образца S сосредоточен на обмотке наблюдения (PO), а затем на детекторе DE.
Оптический путь конфокального сканирования
Конфокальный путь луча в конфокальной системе сканирования представляет собой только комбинацию освещения точечного источника и обнаружения точек. Эта комбинация может быть использована в качестве оптического ножа. Только фотоны из фокальной плоскости могут быть переданы на датчик. В то время как все фотоны из других мест отфильтрованы. Оптическое нарезку реализуется с помощью «пространственного фильтра».
Поскольку только одно место появляется «конфокальная» визуализация в определенное время, для перемещения места в поле объекта необходимо сканирующее устройство в режиме сетки. Обычно оптическое зеркало устанавливается на сканирующем двигателе и используется для выполнения процедуры сканирования. Существует узкое место в то время, необходимое для сканирования полноценной (обычно) 1024 линий. Улучшения были достигнуты путем введения высокоскоростного сканера (резонансного сканера), который сканирует 8, 000 или более строк в секунду.
Только под технологией микроскопа отраженного света может быть достигнут хороший оптический ломтик. Это одна из причин активного развития флуоресцентной микроскопии за последние 20 лет (другие причины включают изобретение иммуноокрашивания, ДНК-гибридизацию, флуоресцентный биосенсор, квантовые точки и флуоресцентный белок).
Рисунок 4: Слева направо: 1. Конус освещения не только возбуждает флуоресцентный краситель в фокальной плоскости, но и возбуждает его вверх и вниз. Здесь представлен зеленый двойной конус. 2. Эмиссия эффективно перехватывает свет, испускаемый сверху в фокальной плоскости. 3. Кроме того, свет снизу фокальной плоскости не пройдет через шестерн. 4. В конфокальной системе только свет от образца достигнет детектора. Обнаружение выходов будет эффективно отвергать любой свет из других областей. Наконец, реальный оптический сечение получено.
